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HPLC常見峰形及異常情況
源葉生物 / 2019-10-15

 一、HPLC

全稱高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography),是一種快速的分離分析技術。HPLC具有高效、高速、高靈敏度、適用范圍廣和流動相選擇范圍廣等特點,因而發展迅速,并在醫藥、食品、化妝品和農藥等很多行業有著廣泛的應用。

二、HPLC峰形

HPLC分析過程中,由于各種原因,經常會出現一些異常峰形,嚴重影響對結果的分析,給實驗人員帶來很大的困擾。下面介紹一些常見的峰形以及可能的原因:

1. 未出峰

可能的原因:

a.       未成功進樣,或樣品未溶解進溶劑中,或樣品分解變質或樣品濃度太低;

b.      儀器本身的問題:泵或者檢測器故障;

c.       流動相選擇不合適,如對于反相硅膠柱來說,若流動相極性太大,是沖不下來一些小極性的物質的,物質一直保留在柱子中,因而不出峰。

d.      檢測器不合適,如:有些產品沒有紫外吸收或者吸收很弱,但是檢測還使用了UV檢測器

2.平頭峰

可能的原因:

a.  樣品濃度過大或進樣體積太大,這個也是大多數原因

b. 檢測器設置不正確

可能的原因:

a.       流動相吸收本底值過高

b.      進樣過程中進入空氣

c.       樣品組分的吸收低于流動相

d.      配制樣品的溶劑與流動相不一致

4.肩峰

 

可能的原因:

a.       進樣量過大;樣品濃度過高

b.      保護柱或色譜柱柱頭堵塞

c.       保護拄或色譜柱污染或失效

d.      色譜柱柱頭塌陷

5.裂峰

 

可能的原因:

a. 溶劑效應:溶解樣品用的溶劑和起始流動相極性相差太大

b. 保護柱或色譜柱柱頭堵塞

c. 保護拄或色譜柱污染或失效

d. 色譜柱柱頭塌陷

 

6.鬼峰

鬼峰(ghost peak)是在某個譜圖里出現,可能同樣的條件再做一次又不出現了,時有時無的峰。

可能的原因:

a. 進樣閥殘余峰,在每次進完樣后用充足的時間來平衡和清洗系統

b. 樣品中存在未知物,改進樣品的預處理

c. 流動相污染,更換新流動相(或者換品牌);盡可能現配現用,隔夜的流動相再次使用時要過濾

d. 流路中有小的氣泡,打開Purge閥,加大流速排除

7. 前伸峰

 

可能的原因:

a. 進樣量或樣品濃度高

b. 溶解樣品的溶劑比流動相極性強

c. 保護拄或色譜柱污染或失效

d. 流動相不合適,更換新流動相(調pH或換種類、比例等)

8. 拖尾峰

 

 

可能的原因:

a. 進樣量或樣品濃度高

b. 流動相不合適,更換新流動相(調pH或換種類、比例等)

c. 硅羥基作用:加入三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值,鈍化樣品

d. 柱內燒結不銹鋼失效:更換燒結不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品

e. 譜柱柱頭塌陷或柱效下降:更換色譜柱

 

注:除以上異常峰形外,HPLC檢測過程中,還有很多其它情況,小伙伴們可以從儀器本身、流動相、固定相(色譜柱)、柱溫和等度與梯度方法學等方面,調整參數,最終找到一種最合適的HPLC方法。

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